MDC- und BIH-Forscher steigern Effizienz des Redigierens im Erbgut – „Innovatives Forschungsgebiet“

„Wofür früher Jahre benötigt wurden, genügen jetzt Monate“, hebt der Genforscher und Immunologe Prof. Rajewsky die Bedeutung der CRISP-Cas9-Technik zur Modifizierung des Genoms hervor. Das CRISP-Cas9-Verfahren macht Forschung nicht nur erheblich schneller, sondern ist zugleich auch effizienter und preiswerter als bisherige Verfahren und zudem leichter zu handhaben.Die CRISPR-Cas9-Technik ermöglicht es an ausgewählten Positionen im Genom von Zellen oder Modellorganismen gezielte DNA-Doppelstrangbrüche zu erzeugen. An solchen künstlich herbeigeführten Bruchstellen können Forscher Gene einfügen, herausschneiden oder den genetischen Code nach Wunsch verändern.  Säugetierzellen verfügen über zwei verschiedene natürliche Mechanismen, um entstandene DNA-Doppelstrangbrüche zu reparieren. Der HDR (homology-directed repair) Reparaturweg ermöglicht das Einfügen (Insertion) vorgeplanter Genmodifikationen mit von außen zugeführten DNA-Molekülen, die Sequenzidentität mit dem Zielgen besitzen und als Reparaturmatrize dienen. Die HDR Reparatur ist sehr präzise aber nur wenig effizient. Der andere Reparaturmechanismus, NHEJ (non-homologous end joining), ist in der Natur wesentlich häufiger und effizienter, da hierbei die DNA-Stränge ohne Reparaturmatrize einfach wieder neu verbunden werden, wobei häufig aber kurze Sequenzbereiche verloren werden. Die NHEJ Reparatur ermöglicht somit nur die Erzeugung kurzer, unpräziser Deletionen, also der Entfernung von DNA-Bausteinen, aber nicht von Insertionen und vorgeplanter Sequenzmodifikationen im Genom. Viele ForscherInnen arbeiten im Labor daran, die Reparaturverfahren für präzisere Modifizierungen des Genoms ohne Redigierfehler zu optimieren, so auch Dr. Van Trung, Prof. Rajewsky und Dr. Kühn. Ihnen gelang es jetzt, die Effizienz des präziser arbeitenden Reparaturverfahrens HDR zu erhöhen, indem sie den in Zellen dominanten Reparaturgehilfen von NHEJ, das Enzym DNA Ligase IV, vorübergehend ausschalteten. Dazu setzen sie unter anderem Proteine und „small molecules“ ein.„Wir nutzen die Trickkiste der Natur, indem wir mit Hilfe von Proteinen von Adenoviren die Ligase IV blockierten und so die Effizienz des Verfahrens bis um das Achtfache erhöhen konnten“, sagt Dr. Kühn. So gelang es den Forschern in über 60 Prozent aller manipulierten Mauszellen ein Gen an einer bestimmten Stelle ins Genom einzufügen (Knock-In). Dr. Kühn leitet am MDC seit kurzem die Forschungsgruppe „iPS zellbasierte Krankheitsmodellierung“ und ist im BIH für die Core Facility "Transgene Techniken" verantwortlich. Zuvor war er am Helmholtz Zentrum München tätig. „Die Expertise von Ralf Kühn ist für die Genforschung am MDC und für unsere Forschungsgruppe von enormer Bedeutung“, betont Prof. Rajewsky.Zeitgleich mit der Arbeit der MDC-Forscher ist eine weitere, ähnliche Publikation zur CRISPR-Cas9-Technologie ebenfalls in Nature Biotechnology erschienen. Sie stammt aus dem Labor von Hidde Ploegh am Whitehead Institut in Cambridge, MA, USA. Nachdem die MDC-Forscher erfahren hatten, dass ähnliche Arbeiten am Whitehead Institute durchgeführt wurden, kamen Kühn/Rajewsky und Ploegh überein, die Veröffentlichung ihrer sich ergänzenden und bestätigenden Ergebnisse zu koordinieren. 

Ziel: Somatische Gentherapie von Krankheiten mit der CRISP-Cas9-Technik

ForscherInnen setzen die erst 2012 entwickelte CRISP-Cas9-Technik bereits zur Korrektur von Gendefekten bei Mäusen im Labor ein. Eine weitere Einsatzmöglichkeit sind im Labor erstellte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), die in bestimmte menschliche Zellen oder Gewebe weiterentwickelt werden können. Mit den neuen Werkzeugen der CRISPR-Cas9 Technik können jetzt in Patientinnen und Patienten identifizierte, krankheitsassoziierte Mutationen in iPS-Zellen eingeführt werden und ermöglichen die Erforschung von Krankheitsmechanismen direkt in menschlichen Zellen. „Langfristiges Ziel ist ebenfalls, die CRISPR-Cas9-Technik auch für die somatische Gentherapie beim Menschen zur Behandlung schwerer Erkrankungen einzusetzen“, erklärt Prof. Rajewsky. Prof. Rajewsky: „Eines der aktuellsten Gebiete in den Lebenswissenschaften und ein innovatives Feld“ „Die Anwendung der CRISPR-Cas9-Technik ist derzeit eines der aktuellsten Themen in den Lebenswissenschaften und ein innovatives Feld“, erklärt Prof. Rajewsky. Er weist darauf hin, dass die neuen Möglichkeiten eines gezielten Redigierens des Erbguts in den USA zurzeit eine intensive Debatte ausgelöst haben, weil die neuen Präzisionswerkzeuge theoretisch auch gezielte Veränderungen der Keimbahn des Menschen ermöglichen. Letztere sind zwar in vielen Ländern, so auch Deutschland, gesetzlich verboten, aber ein weltweites Verbot gibt es nicht. Die MDC-Forscher sind zwar von den durch die CRISPR-Cas9-Technologie eröffneten neuen Chancen für die Grundlagenforschung und Biomedizin fasziniert, lehnen aber gentechnische Manipulation der menschlichen Keimbahn strikt ab. **Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR/Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells
Van Trung Chu¹, Timm Weber¹, Benedikt Wefers^2,3, Wolfgang Wurst^2,3,4 , Sandrine Sander¹, Klaus Rajewsky^1*, Ralf Kühn^1,2,5*
1Max Delbrück-Center for Molecular Medicine, 13125 Berlin, Germany
²Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health, 85764 Neuherberg, Germany
³Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e. V., 81377 Munich, Germany
⁴Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Ludwig-Maximilians-Universität München, 80336 Munich, Germany
⁵Berlin Institute of Health, Kapelle-Ufer 2, 10117 Berlin, Germany
*corresponding authors