OKTOBER 2018 – High prevalence of Streptococcus pyogenes Cas9-reactive T cells within the adult human population

Abstract

The discovery of the highly efficient site-specific nuclease system CRISPR-Cas9 from Streptococcus pyogenes has galvanized the field of gene therapy. The immunogenicity of Cas9 nuclease has been demonstrated in mice. Preexisting immunity against therapeutic gene vectors or their cargo can decrease the efficacy of a potentially curative treatment and may pose significant safety issues. S. pyogenes is a common cause for infectious diseases in humans, but it remains unclear whether it induces a T cell memory against the Cas9 nuclease. Here, we show the presence of a preexisting ubiquitous effector T cell response directed toward the most widely used Cas9 homolog from S. pyogenes (SpCas9) within healthy humans. We characterize SpCas9-reactive T cells within the CD4/CD8 compartments for multi-effector potency, cytotoxicity, and lineage determination. In-depth analysis of SpCas9-reactive T cells reveals a high frequency of SpCas9-reactive regulatory T cells that can mitigate SpCas9-reactive effector T cell proliferation and function in vitro. Our results shed light on T cell-mediated immunity toward CRISPR-associated nucleases and offer a possible solution to overcome the problem of preexisting immunity.

Interview

Im Oktober erhielten Dimitrios L. Wagner und sein Team die Auszeichnung Paper of the Month. Wir haben mit ihm über seine Forschung und die ausgezeichnete Publikation gesprochen:

Woran forschen Sie? Was ist der Kern Ihrer Forschung?

In unserer Publikation erforschten wir mögliche Immunantworten auf die „Genschere“ von CRISPR-Cas9. Mit dieser Technologie zur gezielten Genveränderung beschäftige ich mich im Rahmen meiner Doktorarbeit seit 2015.
CRISPR-Cas9 ermöglicht das gezielte Schneiden von Sequenzen innerhalb des menschlichen Erbgutes. Während eines Forschungsaufenthaltes in den USA half ich ein sehr effizientes CRISPR-Cas9 Protokoll zu etablieren, welches wir heute in Berlin nutzen. Damit erforschen wir Krankheiten indem wir „kranke Gene“ modellieren und den Effekt untersuchen. Außerdem entwickeln wir neuartige Therapieansätze, indem wir Mutationen korrigieren oder bestimmte Gene in Zellen für unsere Zwecke verändern. Der Hauptfokus in unserer Arbeitsgruppe besteht darin menschliche Immunzellen mittels genetischer Veränderungen zu wappnen, sodass die Zellen besser in der Lage sind Autoimmunkrankheiten zu mildern oder Krebs und Infektionskrankheiten zu bekämpfen.

Was motiviert Sie bei Ihrer Forschung?

„Genome Engineering“, also das gezielte Verändern des Genoms, ist zweifelsohne eine der genialsten Methoden, die in diesem Jahrhundert entwickelt wurden. Aktuell revolutioniert CRISPR-Cas9 die biologische Grundlagenforschung weltweit. Internationale Forschergruppen veröffentlichen nahezu täglich neue kreative Ansätze um die Technologie selbst zu verbessern oder Krankheiten zu heilen. Durch unsere Nähe zur Charité und den Patienten liegt uns natürlich viel an dem letzten Teil. Wir möchten einen Beitrag leisten, dass diese mächtige Technologie zum besten Nutzen von kranken Menschen eingesetzt werden kann. Hierbei ist es unserer Meinung nach wichtig, vernünftige und sichere Strategien zu entwickeln.
Das klingt zwar toll, aber ist nicht immer einfach. Forschung im Labor ist sehr zeitaufwändig und oft frustrierend. Ohne tolle Kollegen hätte ich schon häufig aufgegeben. Man teilt die Leiden(-schaft). Die Publikation vom Oktober ist dafür ein tolles Beispiel: ohne den Einsatz des ganzen Teams wäre das Projekt nicht umsetzbar gewesen. Alle haben viel Zeit und Denkarbeit geleistet um es zu realisieren.

Was ist die zentrale Botschaft Ihrer Publikation? Wodurch unterscheidet sich Ihre Studie von den Arbeiten anderer Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler in diesem Feld?

In unserer Studie beschäftigten wir uns mit der Frage, ob die Genschere Cas9 vom menschlichen Immunsystem erkannt wird. In 95 Prozent der gesunden Testpersonen detektierten wir Zellen, die eine Immunantwort gegen die am häufigsten genutzte Genschere auslösen können. Im Falle einer Therapie bei der das Protein der Genschere lang im Körper verbleibt, könnte dies eventuell zu gefährlichen Immunreaktionen führen. Diese Entzündungsreaktionen könnten die Effizienz und Sicherheit solcher Ansätze verschlechtern. Zwei andere Gruppen aus den USA stellten sich dieselbe Frage, aber konzentrierten sich hauptsächlich auf Antikörperreaktionen. Wir schauten uns im Detail an, wie T-Zellen auf das Cas9 Protein reagieren und nutzen dafür sehr sensitive Tests. Des Weiteren identifizierten wir einen bestimmten Zelltyp (sogenannte regulatorische T-Zellen), der ebenfalls Cas9 erkennt. Diese sogenannten regulatorischen T-Zellen waren in der Lage Immunreaktionen gegen Cas9 in der Petrischale zu hemmen. Hier ergeben sich spannende neue Fragen, zum Beispiel ob solche regulatorischen T-Zellen genutzt werden können um CRISPR-Cas9 Therapien sicherer zu machen.

Mit welchen Kooperationspartnern ist die Publikation entstanden? Wer war maßgeblich mit daran beteiligt?

Die Publikation war eine großartige Teamleistung der neu gegründeten Junior-Gruppe um Dr. Michael Schmueck-Henneresse und Teilen der Arbeitsgruppen von Prof. Dr. Hans-Dieter Volk und Prof. Dr. Petra Reinke. Zusätzlich wurden wir vom Immunologischen Studienlabor am Charité Virchow Klinikum tatkräftig unterstützt. Insbesondere hervorheben möchte ich Leila Amini, Desirée Jacqueline Wendering und Lisa-Marie Burkhardt. Leila Amini und Desirée Jacqueline Wendering etablierten im Rahmen ihrer Doktorarbeiten viele der Tests, die wir in der Studie benutzten. Zusammen mit Lisa-Marie Burkhardt ermöglichten Sie die Durchführung eines großen Teils der Experimente, wenn ich durch Pflichtveranstaltungen in der Universität verhindert war. Nur durch den beherzten Einsatz aller Beteiligten war es möglich die Studie so gut und zügig zu Ende zu bringen.

Welche nächsten Schritte sind für das Projekt geplant?

Das Projekt bewegt sich in mehrere Richtungen weiter. Die wichtigste Erkenntnis war, dass ein Einsatz von CRISPR-Cas9 im Menschen zu Immunreaktionen führen kann. Solche Reaktionen sind im Feld der Gentherapie bekannt und müssen unterdrückt werden, um den Erfolg der Behandlung zu sichern.
Aktuell versuchen wir genau herauszufinden, welche Teile der Genschere die Immunantworten hervorrufen. Dies könnte es ermöglichen, neue Enzyme zu schaffen, die vom Immunsystem nicht erkannt werden können.
Zusätzlich kollaborieren wir mit anderen Arbeitsgruppen weltweit um andere Cas9-ähnliche Enzyme auf potentielle Immunantworten zu evaluieren.
Außerdem entwickeln wir Strategien um gefährliche Immunreaktionen während Gentherapie zu unterdrücken. Hierbei fokussieren wir uns auf den Einsatz Cas9-spezifischer regulatorische T-Zellen. Eventuell könnten diese gefährliche Immunreaktionen verhindern oder im Keim ersticken.

Was sind mögliche Implikationen Ihrer Ergebnisse für den Patient*innen?

Wir haben Tests entwickelt, die man klinisch nutzen kann um die Immunreaktionen vor und während der einer Therapie mit CRISPR-Cas9 zu überwachen. Zusätzlich können wir Zellprodukte, die mit CRISPR-Cas9 verändert wurden, nach verbleibenden Cas9 testen. Beides könnte für Studien relevant sein. Dies wird uns auch helfen, eigene Ansätze sicherer zu machen. Wie erwähnt arbeiten wir daran T-Zellen zu verbessern, um effektiver Autoimmunreaktionen oder Viruserkrankungen zu bekämpfen. Bei unserer Strategie verbleiben keine Reste des CRISPR-Cas9 Komplexes in den Zellen zurück. Wir hoffen bald mit einem so sicher genveränderten Zellprodukt Beschwerden nach Organtransplantation zu behandeln.